2026 Hoàng Long. Quy trình thực hiện để nuôi cấy mô lúa invitro trong phòng thí nghiệm

 2026 Hoàng Long. Quy trình thực hiện để nuôi cấy mô lúa invitro trong phòng thí nghiệm

Để thiết lập một quy trình nuôi cấy mô lúa (in vitro) thành công cho cả hai phân loài lúa Indica (lúa hạt dài, trồng ở nhiệt đới) và Japonica (lúa hạt tròn, trồng ở ôn đới), chúng ta cần kiểm soát nghiêm ngặt các điều kiện vô trùng, dinh dưỡng và môi trường.

Dưới đây là các bước thao tác chuẩn (protocol) chi tiết được đúc kết từ các phòng thí nghiệm lớn trên thế giới như IRRI:

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NUÔI CẤY MÔ LÚA

Bước 1: Chuẩn bị và khử trùng mẫu cấy (Explant Preparation & Sterilization)

• Lựa chọn mẫu cấy: Bạn có thể sử dụng phôi non (thu thập khoảng 12 ngày sau khi trổ hoa) hoặc hạt lúa trưởng thành. Việc bóc bỏ lớp vỏ trấu (lemma và palea) cần được thực hiện cẩn thận để không làm tổn thương lớp vỏ quả hay phôi hạt.
• Khử trùng bề mặt: Lắc hạt trong dung dịch cồn 70% trong 1 phút, sau đó chuyển sang ngâm trong dung dịch Sodium hypochlorite 3% hoặc dung dịch tẩy rửa Chlorox 50% (có pha thêm 1-2 giọt chất hoạt động bề mặt Tween-20) trong 30 phút. Để tăng cường hiệu quả khử trùng, có thể hút chân không nhẹ trong 5-10 phút đầu.
• Rửa sạch: Rửa mẫu cấy từ 3 đến 6 lần bằng nước cất vô trùng để loại bỏ hoàn toàn hóa chất.

Bước 2: Cảm ứng tạo mô sẹo (Callus Induction)

• Cấy mẫu: Chuyển các hạt hoặc phôi đã khử trùng lên đĩa Petri chứa môi trường cảm ứng mô sẹo, thường là môi trường MS (Murashige & Skoog) hoặc LS 2.5 có bổ sung hormone 2,4-D (khoảng 2 mg/L).
• Thao tác đặt mẫu: Đặc biệt lưu ý phải đặt hạt sao cho phần phôi (scutellum) hướng lên trên và phần phẳng của hạt tiếp xúc với môi trường. Mô sẹo sẽ phát triển trực tiếp từ bề mặt scutellum này.
• Điều kiện ủ: Sau 3-4 ngày đầu, bạn nên dùng dao mổ vô trùng cắt bỏ các phần chồi và rễ mới nhú, sau đó cấy chuyển phần mô scutellum còn lại sang môi trường mới để ép cây tập trung dinh dưỡng nuôi mô sẹo. Ủ trong bóng tối ở 25°C (đối với lúa Indica) hoặc chiếu sáng liên tục ở 32°C (đối với lúa Japonica).
• Sau khoảng 2-3 tuần, các mô sẹo sinh phôi (embryogenic calli) mềm, có màu trắng vàng sẽ phát triển mạnh trên bề mặt mẫu cấy.

Bước 3: Nhân sinh khối mô sẹo (Callus Proliferation)

• Chọn các khối mô sẹo sinh phôi khỏe mạnh (đường kính khoảng 1.3 - 3 mm) và tách chúng ra khỏi mẫu cấy ban đầu, chuyển sang đĩa môi trường MS-2,4-D mới để nhân sinh khối.
• Tiếp tục ủ trong bóng tối ở 25-28°C trong khoảng 10 ngày. Đây là giai đoạn quan trọng để có đủ lượng tế bào trước khi tiến hành chuyển gen hoặc tái sinh.

Bước 4: Tái sinh chồi (Shoot Regeneration)

• Kích thích chồi: Chuyển các mô sẹo khỏe mạnh sang môi trường tái sinh không có 2,4-D nhưng được bổ sung các hormone kích thích chồi như Kinetin, BAP và NAA. Ví dụ điển hình là môi trường MSKN (chứa 2 mg/L Kinetin và 1 mg/L NAA) hoặc MSD4.
• Điều kiện ủ: Giữ các đĩa cấy trong bóng tối khoảng 10-20 ngày cho đến khi các cấu trúc có tổ chức xuất hiện trên bề mặt mô sẹo. Sau đó, chuyển các đĩa này sang phòng nuôi cấy có chiếu sáng (chu kỳ 16h sáng/ngày, cường độ sáng 110 µmol/m²/s) ở nhiệt độ khoảng 27-32°C. Trong vòng 10-20 ngày, các chồi xanh sẽ bắt đầu vươn lên.

Bước 5: Ra rễ (Rooting)

• Khi các chồi đã hình thành rõ ràng, dùng dao mổ cắt các chồi khỏe và chuyển sang môi trường ra rễ không chứa hormone (ví dụ: môi trường MSO hoặc R07).
• Sau 1-2 tuần nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng, cây con sẽ phát triển hệ thống rễ hoàn chỉnh và đạt chiều cao từ 8-10 cm.

Bước 6: Ra ngôi và thuần hóa cây (Transplanting & Acclimatization)

• Rửa rễ: Dùng kẹp gắp nhẹ nhàng cây con ra khỏi bình cấy, xả rễ dưới vòi nước chảy để rửa sạch toàn bộ môi trường thạch bám vào rễ. Bước này đặc biệt quan trọng để ngăn ngừa nấm mốc làm thối rễ.
• Thuần hóa: Trồng cây non vào hệ thống thủy canh chứa dung dịch dinh dưỡng Yoshida hoặc vào các chậu chứa hỗn hợp đất (peat moss và vermiculite).
• Trong tuần đầu tiên, che đậy chậu cây bằng một túi nilon cắt góc hoặc vòm tạo ẩm (Humi-dome) để duy trì độ ẩm cao, giúp cây quen dần với môi trường bên ngoài. Khi cây đã thích nghi tốt và vươn lá mới, tháo bỏ vòm ẩm và chăm sóc trong nhà kính cho đến khi trổ bông và thu hoạch hạt.

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Để nắm bắt chi tiết về công thức pha chế môi trường (nồng độ khoáng vi lượng, đa lượng, vitamin) và các lưu ý chuyên sâu, bạn có thể tham khảo các tài liệu chuyên ngành chuẩn mực sau:

1.      Datta, K., & Datta, S. K. (2005). Indica Rice (Oryza sativa, BR29 and IR64). Trong cuốn Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols (Trang 201-212). Tài liệu này cung cấp công thức môi trường MS, môi trường nuôi cấy thủy canh Yoshida và quy trình chi tiết nhất cho lúa Indica.

2.      Hervé, P., & Kayano, T. (2006). Japonica Rice Varieties (Oryza sativa, Nipponbare, and Others). Trong cuốn Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols (Trang 213-222). Tập trung vào phương pháp tối ưu giúp tái sinh lúa hạt tròn Japonica với hiệu suất cao lên đến 60% chỉ trong vòng 2 tháng.

3.      Buchholz, W. G., et al. (1998). Production of Transgenic Rice (Oryza sativa subspecies japonica cv. Taipei 309). Trong cuốn Methods in Molecular Biology (Trang 383-397). Nguồn tài liệu nền tảng hướng dẫn chi tiết cách ly phôi lúa non và quy trình chuyển cây từ ống nghiệm ra nhà kính.